Il museo diocesano è allestito in alcuni dei locali che dal 1570 al 1967, ospitarono il Seminario Minore della diocesi di Velletri. Conserva opere d’arte importanti soprattutto per la loro unicità come la “Croce Veliterna”, prezioso reliquiario dell’XI-XII secolo in oro filigranato, perle e smalti.
Nel 1927 il vescovo, cardinale Basilio Pompili, trasferì la raccolta che comprendeva anche altri dipinti: il trasporto della santa casa di Loreto di Giovan Battisti Rositi, proveniente dal convento di santa Maria dell’Orto; la Visitazione di Bicci di Lorenzo dalla cappella Borgia della Cattedrale; la Madonna con Bambino di Antoniazzo Romano conservata nella cripta, ai quali si aggiunsero cessioni temporanee dalle gallerie statali romane come la Sacra Famiglia. I danni bellici al patrimonio artistico cittadino provocarono l’aumento della collezione.
Dopo il furto di gran parte delle oreficerie medioevali, settecentesche e ottocentesche nel 1983, la chiusura per motivi di sicurezza, il restauro di gran parte dei dipinti, il trasferimento nei nuovi locali dal 2000, oggi la raccolta è nuovamente fruibile. Sono state acquisite nuove opere quali l’affresco della Crocifissione, staccato nel 1976 dalla chiesetta del Crocifisso, pertinente il Convento di S. Maria dell’Orto, e attribuito alla bottega di Antoniazzo Romano; il quattrocentesco monumento funebre di Pellegrino Orsini dalla controfacciata della Cattedrale, lo stendardo della confraternita delle Stimmate di san Francesco del 1826 proveniente dalla chiesa omonima.